用粘質沙雷菌合成仿生離子取代和共取代羥基磷灰石納米顆粒

　　摘要

　　仿生學作為生物陶瓷的重要組成部分，以其眾多的功能優勢而日益深入人心。天然羥基磷灰石(HA)除了主要的納米結構外，還具有各種離子取代的特征。容易容納這些關鍵元素到HA晶格是已知的，以提高骨愈合的生物陶瓷的性能。在這項工作中，通過仿生方法合成的羥基磷灰石被單個和多個陽離子所取代，以獲得在骨修復中的潛在應用。利用生長在特定生物礦化介質中的沙雷氏菌，首次在HA上進行了Sr、Mg和Zn的離子置換。對沙雷菌HA (SHA)中不同濃度取代離子(Sr SHA、Mg SHA和Zn SHA)的結晶度、官能團、形態和晶體大小進行了分析。三者均表現出結晶度降低，相純度降低，團聚體大，呈針狀形貌。傅里葉變換紅外光譜(FTIR)顯示碳酸鹽含量增加5.8%，與天然骨相似。此外，降低的O-H強度清楚地描述了HA晶格的破壞和隨后的離子取代。本研究的新穎之處在于研究了1% Sr、Zn和Mg的組合在SHA中的共取代，并建立了相關的骨參數變化。掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)圖像清楚地顯示了Sr SHA平均長度為20-50 nm，寬度為8-15 nm的均勻納米團聚體;Zn SHA和Mg SHA均為10-40 nm長，8-10 nm寬，Sr, Zn, Mg SHA為40-70 nm長，4-10 nm寬。在個體和共取代中，沒有觀察到明顯的峰移，可能是由于濃度較低。然而，在這兩種情況下，細胞體積都增加了，因為Sr2+的存在證實了它在SHA晶格中的主導整合。利用能量色散x射線能譜(EDS)和電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP-OES)對富微量離子沉積進行了定量分析。體外細胞毒性研究表明，NIH/3T3成纖維細胞、Mg -63骨肉瘤細胞和RAW 264.7巨噬細胞的細胞活力超過90%，證明了1% Sr、Zn和Mg在SHA中的生物相容性。沙雷菌的微生物生物礦化產生的HA納米晶體模仿“骨狀磷灰石”，其純相、碳酸基、結晶度降低、納米團聚、細胞參數變化、豐富的離子沉積和無毒性質證明了這一點。因此，離子取代和共取代生物礦化納米SHA具有與人骨相似的特性，是解決骨損傷和促進再生的生物醫學應用的合適候選材料。

　　簡介

　　透明質酸是磷酸鈣家族中*重要的物質之一。由于其特殊的生物相容性、高吸收和體內緩慢的溶解速率，它在醫療行業中占據主導地位，應用廣泛。雖然HA的固有元素組成類似于牙齒和骨骼的礦物成分;它們表現出較差的機械強度和疲勞性能。這是由于與納米HA相比，HA的晶粒尺寸更粗，限制了其在非承載應用中的應用。盡管具有優異的導電性和生物相容性，但低韌性和脆性的局限性導致了不可靠性2。目前，臨床和實驗研究主要圍繞著開發具有仿生學特征的生物陶瓷，以克服這些限制并提高生物性能。特別是，將各種離子取代到HA的納米結構中，以改變其生物相容性、燒結性和力學性能，反映了人們對其日益增長的興趣1。因此，生物磷灰石的獨特之處在于大量外源離子的存在，根據劑量有效地促進骨修復。生物磷灰石與化學計量HA的不同之處在于其磷灰石晶格上普遍存在不同數量的替代離子，包括陰離子(F?、Cl?、SiO44?和CO23?)和/或陽離子取代離子(Na+、Mg2+、K+、Sr2+、Zn2+、Ba2+、Al3+)3。在此之前，純HA的斷裂韌性在0.5-1 MPa m2 /2到2.7 MPa m2 /2的范圍內得到了提高，濃度為5 at時，濃度為0.6 wt% Mg，濃度為1.5 MPa m2 /2。%鋅。此外，這種陽離子取代增加了生物活性，表面反應性，并顯示出良好的細胞增殖能力4。多離子取代或共取代等離子的摻雜也被報道產生多面屬性5,6。

　　眾所周知，HA晶格由于具有較高的結構靈活性，可以在其晶格內容納周期體系中近一半的元素;允許不同的替代離子取代其三個亞晶格，即Ca2+， PO43?和OH?。因此，這種結合會影響HA的物理化學和生物特性。晶體結構、結晶度、熱穩定性、表面電荷、溶解度、體外生物活性、體外破骨細胞和成骨細胞反應性以及體內骨再生3。二價陽離子(如Sr2+， Ba2+， Mg2+，…)和單價陽離子(如Na+， K+，…)主要替代Ca2+位點。這些陽離子在骨骼中的存在對骨骼的形成和再吸收有很大的貢獻。例如，缺乏Mg2+離子會降低成骨細胞的生長速度，導致骨密度降低。而Zn2+離子通過加速生長速度促進骨形成，而Sr2+在人體內即使大劑量也無毒，具有促進骨形成和減少骨吸收的雙重特性6,7,8。文獻強調了這種離子取代HA材料的生物性能的提高9。Sr HA除了防止骨吸收和改善力學性能外，在體內兔模型中也表現出更高體積的新骨形成。同樣地，Zn HA在大鼠和兔子模型體內分別植入1個月和2個月后也表現出增強的新骨形成。在新西蘭白兔體內試驗中，將Mg (15 at.%)作為股骨缺損的填充物，顯示骨導電性增加4。

　　事實上，已知骨骼中存在的這種離子在血液中起緩沖作用，并直接影響成骨細胞和破骨細胞的增殖8。更有趣的是，一些離子(如Sr2+和Zn2+)會降低HA的結晶度，從而促進溶解，而其他離子(如F?)則會增強HA的結晶度，從而減少溶解10。此外，已知Sr2+和/或Zn2+可以抵消由于高濃度Ag離子引起的任何細胞毒性11。此外，在Zn2+和Mg2+共摻雜的nHA結構中觀察到增強的宿主骨愈合而沒有不良的細菌感染和炎癥反應12。*近，一種由Sr2+和Mg2+(含5mol %的Sr和5mol %的Mg)納米羥基磷灰石(n-HAs)與磷酸二鈣和殼聚糖/明膠聚合物共取代的新型骨水泥顯示出異常的成骨活性，可促進骨再生13。因此，這種離子的共取代結合了幾種可取的特性，比HA的單獨離子取代提供了有利的環境。然而，共取代離子的選擇需要仔細考慮原子取代位點、相穩定性、生物影響和離子電荷平衡14。

　　本研究為了進一步增強合成的HA的性質和對稱性，首次采用仿生合成方法研究了Serratia sp.生物礦化HA的離子取代15。研究了陽離子的單獨和共取代，并對其在官能團、結晶度、形態和生物相容性方面的能力進行了表征。將細菌合成的HA與Sr、Zn和Mg離子組合共取代，以模擬生物磷灰石，并了解其在骨修復中的應用優勢。對這種離子替代的研究可能有助于更好地理解生物礦化過程，以控制沉淀相的性質，增加生物活性和治療骨病的離子輸送16。

　　材料與方法

　　所有使用的化學試劑均為分析級。氯化鈣(CaCl2)、氯化鍶(SrCl2)、氯化鋅(ZnCl2)、氯化鎂(MgCl2)、檸檬酸三鈉、三緩沖液和甲苯從印度SRL化學品公司采購。β-甘油磷酸二鈉鹽二水合物，對硝基苯磷酸鹽(p-NPP)采購自Sigma-Aldrich(印度)。營養液、Dulbecco 's改良鷹鷹培養基(DMEM)、*低必需培養基(MEM)、抗生素青霉素-鏈霉素、胎牛血清(FBS)購自印度Himedia。

　　利用革蘭氏陰性沙雷菌合成HA

　　粘質沙雷氏菌在錐形瓶中100ml營養肉汁培養基中培養，30°C孵育15小時。3500 rpm離心15分鐘收集細胞，0.85% NaCl洗滌。將細胞懸液添加到由10mm氯化鈣、25mm β-甘油磷酸二鈉鹽二水合物、20mm檸檬酸三鈉和25mm三鈉緩沖液組成的礦化介質中，pH調至8.517。沙雷氏菌在礦化介質中孵育10天后，收集白色沉淀物，在100℃下干燥7 h。

　　鍶(Sr)或鋅(Zn)或鎂(Mg)取代的HA納米顆粒的合成

　　礦化介質中的鈣離子被Sr、Zn或Mg離子取代，得到相應的離子取代HA。確保培養基中離子的濃度不影響細菌培養條件是至關重要的。沙雷氏菌在前面“使用革蘭氏陰性沙雷氏菌合成HA”章節中所述的條件下進行了HA的合成。將礦化介質中的CaCl2替換為3,5和10% SrCl2，收集到的沉淀分別為3% Sr SHA, 5% Sr SHA和10% Sr SHA。同樣地，在礦化介質中以2、4和6% ZnCl2取代CaCl2，收集到相應的2% Zn SHA、4% Zn SHA和6% Zn SHA沉淀。同樣地，2,4和6% MgCl2取代了CaCl2。而沙雷菌僅在2% MgCl2濃度下析出HA。收集2% Mg SHA沉淀，在100°C下干燥7 h并分析。

　　共取代HA的合成

　　為了開發一種類似于骨礦物的磷灰石，進行了離子共取代。這三種離子(Sr, Mg, Zn)在礦化介質中被1%的SrCl2, MgCl2, ZnCl2取代，如“使用革蘭氏陰性細菌沙雷菌合成HA”部分所述，并通過沙雷菌進一步合成HA。沙雷菌僅在培養基中SrCl2、MgCl2、ZnCl2濃度的1%時析出HA。收集1% Sr, Mg, Zn SHA納米顆粒粉末，在100°C下干燥7 h并分析。

　　合成的離子取代納米顆粒的表征

　　采用FTIR、XRD、SEM、TEM和ICP-OES等技術對離子取代納米顆粒和共取代納米顆粒進行了表征。采用FTIR (Perkin-Elmer Spectrum Two, USA)在500-4000 cm?1范圍內分析樣品的官能團，分辨率為4 cm?1。采用Cu/Kα輻射(λ = 1.54 ?)，掃描速率為1 step/s，步長為0.10，用XRD (Bruker D8 discover powder XRD，德國)記錄了樣品的衍射圖譜。利用“UnitCell”18程序計算XRD數據得到細胞體積和細胞參數。在10 kV加速電壓下進行金濺射后，用配有能譜儀(FEI Quanta FEG 200，荷蘭)的掃描電鏡(SEM)對樣品的表面形貌和元素組成進行了檢測。在120 keV (Philips CM20 TEM, Netherlands)下，用透射電鏡(TEM)測定了晶體的形貌和粒徑。TEM樣品是通過將分散在乙醇中的納米顆粒滴入碳涂層的銅網格中制備的。使用ICP-OES Perkin Elmer Optima 5300 DV，美國對樣品中幾種離子的定量測量進行了評估。將10-15 mg樣品粉末溶解在3 ml 1 M硝酸和27 ml蒸餾水中，并對總30 ml溶液進行ICP-OES分析。

　　生物相容性評價

　　用MTT法測定制備的納米顆粒對NIH/3T3成纖維細胞、MG-63骨肉瘤細胞和RAW 264.7巨噬細胞的細胞毒性15,19,20,20。將細胞株在96孔板中培養至細胞密度為1 × 104 /孔，與細胞培養基孵育24小時21。細胞單層形成后，用濃度為100 μg μL?1的納米顆粒處理細胞，孵育24 h。24 h后，取出培養液，PBS洗滌，然后用100 μL 0.5 mg mL?1的MTT[3-(4,5 -二甲基噻唑-2-基)- 2,5 -二苯四溴化銨]溶液替換每個孔培養基，繼續孵育3 h，然后用200 μL DMSO(二甲基亞砜)替換MTT溶液。使用平板閱讀器(Enspire, Perkin Elmer, USA)在570nm處測量井的光密度(OD) 22。樣本中細胞活力的百分比相對于對照使用以下公式計算:

　　$$\% Cell\;viability = 100 \times \frac{OD\;of\;sample}{{OD\,of\;control}}$$

　　結果與討論

　　單獨和共取代SHA

　　研究的離子的濃度范圍是根據先前的文獻12,23選擇的。在Sr和Zn取代SHA的情況下，在所有三種濃度上都成功沉積。然而，只有較低濃度的2% Mg supported HA deposition by Serratia. This is in line with the well-established inhibitory effect of Mg on HA nucleation and growth24,25. Mg substitution for Ca occurs only over a limited composition and in terms of bacterial deposition 2% was the threshold. Co-substitution was possible only with 1% of SrCl2, MgCl2, ZnCl2 concentration in the mineralization media.

　　紅外光譜分析

　　三種離子取代和共取代(圖1a, b, c, d)在不同濃度下的FTIR光譜顯示了與SHA光譜相似的特征HA基團的存在。O-P-O彎曲振動的560,598 cm?1 (ν4)和P-O彎曲振動的1021 cm?1 (ν3)峰的存在表明了HA對應的磷酸基。這些結果與先前關于Sr, Zn和Mg取代的報道一致26,27。在1的情況下% Sr, Mg, Zn co-substituted SHA the most intense band of asymmetric stretching ν3, lower intensity bending modes of asymmetric ν4 doublet and faint symmetric stretching ν1 mode was witnessed, in line with prior results28.

　　此外，在1413 cm?1處的特征碳酸鹽條帶(ν3 -拉伸模式)被認為是HA晶格中部分取代的磷酸鹽基團。而與CO32?重疊的HPO42?在872 cm?1處的強波段(ν2-彎曲模式)清楚地證明了離子取代。此外，a型HA在877-880 cm?1、1500 cm?1和1540-1550 cm?1波長處的特征振動和ab型HA在1515 cm?1波長處的特征振動均未觀測到29。從而證實了SHA在所有離子取代中都存在b型碳酸化。由于這種b型碳酸磷灰石具有生物可吸收性、誘導成骨細胞反應和增強成骨細胞分化的能力，被認為是一種有效的骨替代材料30。CO32?的含量為5.8% in the case of co-substituted SHA and this is known to improve the bioactivity of HA owing to its resemblance with carbonated bone mineral phase.

　　用公式計算CO32 -代換率

　　$${\text{Wt}}.\% {\text{ CO}}_{{3}} = \, \left( {{28}.{62 } \times {\text{ r}}_{{{\text{c}}/{\text{p}}}} } \right) + 0.0{843}$$

　　其中r c/p是CO32?帶(1570-1330 cm?1)和PO43?帶(1230-900 cm?1)之間的面積比31,32。

　　由此可見，OH?離子從單位細胞中流失，證明Sr、Zn、Mg離子明顯取代SHA晶格。先前報道了Mg取代HA在630 cm?1和3570 cm?133處OH-振動模式強度的降低。同樣，在Zn取代HA的情況下，OH -的拉伸振動模式被報道為較低，這是由于OH -和PO43-34之間由氧產生的氫鍵。

　　還值得注意的是，文獻表明離子濃度的增加對應于結晶度的降低。然而，在本研究中，由于所研究的濃度較低，這四種情況中的任何一種都沒有出現這種峰的擴大。*后，在3374 cm-1處的寬頻帶對應于吸附在表面的水35。

　　XRD分析

　　對比了SHA和離子取代HA粉體的XRD譜圖(圖2a, b, c和d)，在所有情況下，與HA相關的反射均與參考文獻JCPDS 09-0432相關。可見HA結晶度較低的特征峰。沒有證據表明有任何二次相，如貨幣石或刷石，因此所獲得的產品都是純相5。據報道，峰展寬的增加與晶體尺寸的減小直接相關。這種低分辨率的峰描述了納米尺度(≤100納米)的性質和HA晶格內可觀的取代水平26。此外，在獨特的HA峰沒有明顯的變化被記錄，可能是由于較低的離子濃度研究5,6。

　　關于結晶度，報告討論了離子對細胞體積和晶格參數的影響。表1描述了所有樣品的晶格參數a和c以及單位細胞的六邊形體積(圖2a, b, c和d)。鍶比HA結構的Ca (I)更傾向于排列在“交錯”等邊三角形頂點的Ca (II)位點。由于其較高的離子半徑大于鈣，容易容納在Ca (II)中。這種占用偏好可能是結晶度降低的原因。此外，通過將單位細胞從526.46擴大到540.15 ?336進行驗證。相反，與Sr SHA相比，Zn SHA和Mg SHA顯示細胞體積減少，在2% Mg SHA的情況下為526.46至524.1 ?3，在6% Zn SHA的情況下為517.79 ?3，與先前的報道一致33。

　　此前，Matsunaga等人通過第一性原理計算建立了二價陽離子與HA的離子交換能力。離子交換能力取決于離子的大小。對于Ni2+、Mg2+、Cu2+和Zn2+等尺寸較小的陽離子，第一個*近鄰(NN)氧離子優先于Ca (I)位。然而，在Ca (I)位點的大尺寸陽離子Sr2+， Pb2+， Ba2+的情況下，第一個NN氧離子被看到從Ca (I)位點移出它們的位置37。

　　沿著這些路線，由于Mg2+的離子半徑較小(即0.69 vs. 0.99 ?)，用Mg2+替代Ca2+使單位細胞更小，并由于晶格畸變導致結晶度降低。類似地，HA晶格內較小的Zn2+離子取代Ca2+離子，導致單位細胞參數的收縮38。本質上，Sr2+和Ca2+的離子半徑差小于Zn2+和Mg2+與Ca2+的離子半徑差。因此，在Sr, Zn, Mg SHA含量為1%的情況下，細胞體積增加至531.07 ?3。值得注意的是，如前所述，具有10% Sr SHA取代的Sr反映了*大的細胞體積，表現出其在SHA晶格中的取代優勢，無論是單獨取代還是共取代形式。眾所周知，鎂離子會破壞HA結構的穩定，促進β-TCP(磷酸三鈣)的形成，而鍶離子能夠很容易地在HAp晶格中取代，保持單一的HAp相33。由于Sr的加入帶來了相純度和穩定效果，從而實現了高效的取代平衡。

　　在晶格參數方面，“a”和“c”的變化是取代HA的理想選擇。然而，“a”和“c”的變化程度取決于取代基的類型和取代量(表1)。取代對HA晶格參數和傾斜溶解度的詳細影響已在前面說明9。在這里，細化記錄了晶格參數a和c隨著Zn取代降低到6%，這也與Li et al.34的觀察結果一致。Zn - SHA在“c”格中呈現不規則的趨勢。早期的報告報告了隨著鋅濃度的增加而降低的值39。然而，一些報道也將觀察到的晶格參數“c”的增加，在六方軸2b位點占據了一個新的位置，在這個位置上，Zn將鄰近的O4(羥基- o)原子分開，通過吸引O3(磷酸- o)原子和縮小“a”方向40或通過H2O分子簡單地取代OH-基團而擴大c方向并扭曲了附近的磷酸鹽四面體39。